SeeDB實現(xiàn)生物體樣本深層成像
今井猛博士等人開發(fā)了一種對于水溶性生物體組織的形態(tài)和組成在不破壞熒光蛋白以及熒光神經(jīng)同位素的條件下,可快捷簡便地使大腦等生物體組織透明化的方法——SeeDB。SeeDB由水、果糖、還原劑構(gòu)成。
SeeDB法是在使用共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)顯微鏡下可深層成像的方法?？衫脽晒獾鞍缀蜕窠?jīng)示蹤劑，實現(xiàn)對熒光神經(jīng)回路的全貌闡明和定量分析等各種各樣的應(yīng)用。
◆SeeDB protocol案例
SeeDB法，可用于脊椎動物的各種組織，下面以小鼠大腦為例進行介紹。
１．固定
① 將小鼠大腦在4%多聚甲醛/PBS，4℃下固定過夜。
② 樣本用PBS清洗三次（每次清洗10分鐘）
２．透明化處理
③ 將樣品加入放有20 mL的SeeDB:20 w/v%果糖溶液的50 mL錐形瓶中。
在室溫下在旋轉(zhuǎn)器中旋轉(zhuǎn)4-8小時（約4 rpm）
在脆弱的樣本和薄片情況也可以用壓板式搖床（約17 rpm）
④ 將樣本加入放有SeeDB:40 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時。
⑤ 將樣本加入放有SeeDB:60 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時。
⑥ 將樣本加入放有SeeDB:80 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時。
⑦ 將樣本加入放有SeeDB:100 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時。
⑧ 將樣本加入放有SeeDB的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)24小時。
長時間可延長至48小時。在透明化成功時，透光可觀察到組織透明化。
３．觀察
⑨ 將SeeDB處理過的大腦樣本置于共聚焦顯微鏡或雙光子激發(fā)顯微鏡下觀察。
（注意點）
樣本用SeeDB液固定。用SeeDB透明化處理后的樣本折射率可達(dá)到1.49。因此，物鏡中應(yīng)該有甘油浸沒透鏡、油鏡、透明化用鏡片，即使浸水鏡頭到達(dá)2 mm深度也是沒有問題的。浸沒式鏡片請使用浸沒液，SeeDB不能用作浸沒液。在使用干式鏡頭（折射率1.0）和浸水鏡頭（折射率1.33）獲取畫像情況下，需要補正深度值（補正值請參考相關(guān)文獻(xiàn)）。
SeeDB 處理案例
SeeDB生物體樣本透明化
左起依次為經(jīng)SeeDB液透明化處理的小鼠幼胎（幼胎12天）
新生鼠（生后3天）的全腦、成鼠大腦（8周齡，厚度2 毫米）
SeeDB 觀察案例
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雙光子激發(fā)顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周齡）大腦熒光成像 使用Olympus公司產(chǎn)品 多光子物鏡：XLPLN10XSVMP觀察案例 | 共聚焦顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周齡）大腦熒光成像 使用Olympus公司產(chǎn)品 有機硅浸沒式物鏡：UPLSAPO 10X2觀察案例 |
雙光子激發(fā)顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠
（10周齡）大腦熒光成像
使用Olimpus公司產(chǎn)品
多光子物鏡：XLSLPLN25XGMP觀察案例
比例尺：100 微米
小鼠大腦固定后用Dil標(biāo)記，SeeDB透明化處理案例
左：嗅球僧帽細(xì)胞樹突（橫向觀察）
右：嗅球僧帽細(xì)胞樹突（縱向觀察）
使用Olympus公司產(chǎn)品
有機硅浸沒型物鏡：UPLSAPO 20X觀察案例。比例尺：100 微米。
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 |
| 291-79601 | SeeDB實驗試劑盒 | 1 kit | 組織透明化 |
| 193-18391 | SeeDB:20w/v% 果糖溶液 | 250 mL | 組織透明化 |
| 196-18401 | SeeDB:40w/v% 果糖溶液 | 250 mL | 組織透明化 |
| 193-18411 | SeeDB:60w/v% 果糖溶液 | 250 mL | 組織透明化 |
| 190-18421 | SeeDB:80w/v% 果糖溶液 | 250 mL | 組織透明化 |
| 197-18431 | SeeDB:100w/v% 果糖溶液 | 250 mL | 組織透明化 |
| 194-18441 | 深層透明化試劑 | 250 mL | 組織透明化 |
SeeDB實現(xiàn)生物體樣本深層成像
