產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

是EZ-Tn5轉(zhuǎn)座酶和EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子之間形成的穩(wěn)定復(fù)合物。EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子包含R6Kγ條件復(fù)制起點(diǎn)（R6Kγori）和在大腸桿菌中有功能的Tn903kan抗性基因（KanR），側(cè)翼是19堿基對(duì)活躍的Mosaic End（ME）EZ -Tn5轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列。EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子可以電穿孔進(jìn)入活細(xì)胞，在宿主細(xì)胞的環(huán)境中，Mg2 +激活EZ-Tn5轉(zhuǎn)座酶，從而將EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入宿主的基因組DNA中。

R6Kγori使該轉(zhuǎn)座子可用于“營(yíng)救"隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子的基因組DNA區(qū)域。 第2頁(yè)概述了營(yíng)救克隆過(guò)程。首先將轉(zhuǎn)染EZ-Tn5的轉(zhuǎn)座子的基因組DNA純化，然后進(jìn)行片段化，自連接，最后轉(zhuǎn)化為表達(dá)pir的大腸桿菌宿主。 基因產(chǎn)物（“ pi"蛋白）。在含kan的平板上選擇時(shí)，只有包含轉(zhuǎn)座子的細(xì)胞才能生長(zhǎng)。

試劑盒中提供了未標(biāo)記的正向和反向轉(zhuǎn)座子特異性引物。 這些引物可用于雙向DNA測(cè)序或靶基因組DNA或救援克隆中轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的作圖。

組成成分：

? EZ-Tn5Tnp Transposome (0.1pmol/µL)：儲(chǔ)存在-20°C

? KAN-2 FP-1 Forward Primer (50   µM)：儲(chǔ)存在-20°C

? R6KAN-2 RP-1 Reverse Primer (50 µM)：儲(chǔ)存在-20°C

? Nuclease-Free Water, Sterile：儲(chǔ)存在-20°C

數(shù)據(jù)：

可以將EZ-Tn5轉(zhuǎn)座體復(fù)合物電轉(zhuǎn)到活細(xì)胞中，在其中隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)，可以是宿主的基因組DNA。 EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)可以通過(guò)多種方法進(jìn)行分析。

相關(guān)產(chǎn)品：

? TypeOne Restriction Inhibitor（# TY0261H）

? TransforMax EC100D pri+ Electrocompetent  E.coli（# ECP09500 ）

? TransforMax EC100D pir-116 Electrocompetent  E.coli（# EC6P095H）

參考文獻(xiàn)：

1. Hoffman, L.M. and Jendrisak, J. (1999) Epicentre Forum, 6 (3), 1.

2. Goryshin, I.Y. et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18, 97.

3. Metcalf, W.W. et al.,   (1994) Gene, 138, 1.

注：使用EZ-T連接試劑盒應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)程，以防細(xì)菌污染造成試劑盒組分失效。

2．混合，短暫離心。
3．25℃反應(yīng)5分鐘。
4．取2 μl連接反應(yīng)液加入至50 μl感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。
5．42℃加熱45~60秒鐘，冰中放置2分鐘。
6．加入800 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37 ℃250 rpm振蕩培養(yǎng)40~60分鐘，使β-內(nèi)酰胺酶基因表達(dá)。
7．在含有X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
8．挑選白色菌落，使用質(zhì)?？焖偬崛》ǎ‥Z-Lyse克隆快速檢測(cè)試劑盒，Cat No. T171）或菌落PCR法（EZ-PCR重組菌落PCR檢
測(cè)試劑盒，Cat No. T172）鑒定是否有插入片段。

FAQ
Q1：TA克隆對(duì)PCR產(chǎn)物有何要求？
A1：首先，PCR應(yīng)使用無(wú)校讀活性的DNA聚合酶(如Taq或Tth)以確保PCR產(chǎn)物的3’末端有突出的A堿基。使用高保真DNA聚合酶(如Pfu、Pfx、Pwo、Vent、Phusion、KOD等)擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物不能直接進(jìn)行TA克隆，但可使用Taq DNA聚合酶添加3’-端A堿基后，再與T載體連接。其次，TA克隆zuihao使用經(jīng)過(guò)純化的PCR片段。特異性好的PCR產(chǎn)物可不經(jīng)過(guò)切膠回收純化，但應(yīng)采用柱純化或乙醇沉淀的方法去除殘留引物、dNTP、引物二聚體等，再與T載體連接，否則影響克隆效率。

Q2：PCR引物設(shè)計(jì)對(duì)TA克隆效率有無(wú)影響？
A2：引物的5’-末端設(shè)計(jì)為G或A更有利于提高TA克隆效果。

Q3：為何有時(shí)切膠回收的PCR產(chǎn)物TA克隆效率仍然很低？
A3：經(jīng)切膠回收純化的PCR產(chǎn)物具有更高的TA克隆陽(yáng)性率。然而如果PCR產(chǎn)物在紫外線下暴露的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起DNA變性而降低連接效率。因此切膠時(shí)動(dòng)作要快，盡量減少紫外線下暴露的時(shí)間。

Q4：為何有時(shí)切膠回收的PCR產(chǎn)物TA克隆后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)插入的片段大小不一？
A4：切膠回收應(yīng)采用新鮮配置的瓊脂糖凝膠和電泳緩沖液，否則回收的DNA片段極有可能被凝膠或電泳緩沖液中殘留的DNA污染。

Q5：為何有時(shí)得到的藍(lán)色菌落也含有插入片段？
A5：1 kb以下的插入片段在沒(méi)有破壞lacZ基因的讀碼框的情況下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色或淡藍(lán)色的菌落。因此如果觀察到整板都是藍(lán)色或淡藍(lán)色菌落時(shí)，不妨挑選一些進(jìn)行篩選。

Q6：EZ-T載體可以克隆的PCR片段大小的上下限是多少？
A6：EZ-T載體推薦用于克隆50 bp~3 kb的PCR片段。經(jīng)驗(yàn)表明，3 kb以上片段的連接和轉(zhuǎn)化效率比較低，此時(shí)可通過(guò)加大EZ-T載體用量、適當(dāng)延長(zhǎng)連接時(shí)間和使用轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞來(lái)提高克隆陽(yáng)性率。